آزمایش موش های صحرایی در شرایط °c24-22 و سیکل روشنایی خاموشی 12 ساعت (هفت صبح تا 7 شب روشن و 7 شب تا 7 صبح تاریک) نگهداری می شدند. به جز در شرایط آزمایش، آب و غذا بصورت آزاد در اختیار آنها قرار می گرفت.
?-?- مواد مورد نیاز:
– موش صحرایی نر بالغ
– خوراک موش صحرایی
– آب مقطر
– پنبه و گاز
– کتامین و زایلازین
– تیوباربیتوریک اسید
– تری استو استیک اسید
– نیتروژن مایع
– فرمالین 10%
– کیت سنجش ALT، AST، ALP وLDH
– کیت سنجش بیلی روبین، آلبومین، گلوکز، کلسترول و تری گلیسیرید
– هماتوکسیلین
-ائوزین
-پارافین
– چسب انتلان
– کوئرستین
– سولفات آهن
?-?- وسایل مورد نیاز:
– میز جراحی
– وسایل جراحی (انواع قیچی و پنس)
– حمام آب
– PH متر
– ترازوی دیجیتال با دقت صدم گرم
– ترازوی مخصوص توزین موش
– میکروپیپت
– تانک ازت
– فریزر 80- درجه سانتیگراد (آزمایشگاه مرکزی)
– دستگاه میکروسانتریفیوژ (آزمایشگاه مرکزی)
– دستگاه اسپکتروفتومتر(آزمایشگاه مرکزی)
– میکروسکوپ نوری
– میکروسکوپ مجهز به دوربین عکاسی (اطاق تجهیزات میکروسکوپی)
– نیدل گاواژ مخصوص موش صحرایی
– یخچال فریزر
– انکوباتور (آزمایشگاه تکوین)
– میکروتوم دوار (آزمایشگاه تکوین)
– سرنگ خونگیری
– اپندروف
– کرایوتیوب
– سرسمپلر
– جار رنگ آمیزی
– لام و لامل
– دستگاه هموژنایزر (آزمایشگاه مرکزی)
?-3- گروه های آزمایشی
پنج گروه از موشها مورد آزمایش قرار گرفتند (n=7) :
گروه شاهد (Sham): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام شد و به مدت 14 روز (روزی یک بار) یک میلی لیتر آب مقطر به صورت گاواژ به حیوانات داده شد.
گروه دریافت کننده حلال Sham+DMSO)): در این گروه تمام شرایط همانند گروه شاهد است با این تفاوت که تزریق درون صفاقی حلال کوئرستین (دی متیل سولفوکسید) به میزان یک میلی لیتر، به مدت 14 روز (روزی یک بار) دریافت شد.
گروه دریافت کننده کوئرستین (Sham+Q): در این گروه تزریق درون صفاقی کوئرستین به میزان 50 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن در یک میلی لیتر حلال (دی متیل سولفوکسید) به مدت 14 روز (روزی یک بار) صورت گرفت.
گروه دریافت کننده سولفات آهن (FS): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام گرفت و به مدت 14روز (روزی یک بار) تزریق درون صفاقی 30 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن سولفات آهن در یک میلی لیتر آب مقطر به حیوانات داده شد.
گروه دریافت کننده سولفات آهن + کوئرستین (FS+Q): در این گروه تمامی مراحل آزمایش مطابق با پروتکل آزمایش انجام شد و به مدت 14 روز (روزی یک بار) تزریق درون صفاقی 30 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن سولفات آهن در یک میلی لیتر آب مقطر به حیوانات صورت گرفت. در این گروه از روز چهارم تزریق درون صفاقی کوئرستین به میزان 50 میلی گرم به ازاء هر کیلو گرم وزن بدن در یک میلی لیتر حلال (دی متیل سولفوکسید) به مدت 11 روز (روزی یک بار) انجام شد.
?-?- روش آماده سازی حیوانات
بعد از اتمام 14 روز حیوانات با کتامین-زایلازین بیهوش شدند و پس از ثابت کردن آن ها بر روی میز جراحی، یک برش طولی بر روی شکم آن ها ایجاد می شد و با باز شدن آن، نمونههای خون از بطن قلبشان با استفاده از سرنگ گرفته شد و پس از گذشت چند دقیقه، سرم خون توسط دستگاه سانتریفیوژ مدل () جدا سازی و جهت اندازهگیری پارامترهای مختلف در دمای 20- درجه سانتی گراد، نگهداری شد. در پایان بافت کبد حیوان جدا و توزین شد. به منظور اندازه گیری میزان لیپید پراکسیداسیون و سنجش آنزیمهای موجود در بافت کبد سریعاً بخش های مشخصی از کبد بر روی یخ خشک جدا شده و در نیتروژن مایع در دمای ?80- نگهداری شد. سپس بخش مشخصی از کبد جهت مطالعات هیستوپاتولوژی جدا و در فرمالین 10% تثبیت گردید.
?-?- سنجش میزان فعالیت آنزیمهای ALT، AST، ALP و LDH در سرم و بافت کبد:
تعیین میزان فعالیت آنزیمهای ALT، AST، ALP و LDH موجود در سرم و بافت کبد، با استفاده از کیت سنجش آنزیم ساخت شرکت پارس آزمون انجام گرفت.
به منظور آمادهسازی بافت برای اندازهگیری آنزیم، ابتدا بافت مورد نظر در یک میلی لیتر از بافر سیترات با PH= 4/8 هموژنه گردید. پس از سانتریفیوژ نمودن نمونه، محلول فوقانی موجود در اپندورف جهت سنجش فعالیت آنزیمها مورد استفاده قرار گرفت. در نمونه های خونی نیز، فعالیت آنزیم ها در سروم خون سنجش و اندازه گیری شدند.
نحوه تهیه محلول بافر سیترات با PH=4/8
استاک A (0/1 M سیترات سدیم با MW=294/10)
استاک B (0/1 M اسید کلریدریک با MW= 36/46)
بافر سیترات با PH=4/8: با مخلوط کردن 1 میلی لیتر استاک A و 2/9 میلی لیتر استاک B، تهیه میشود.
?-?-1- اندازه گیری آنزیمها بر اساس کیت:
برای اندازهگیری، از روش دومحلوله استفاده شد. در این روش، میزان مشخصی از نمونه با معرف شماره یک مخلوط شد. پس از 5 دقیقه انکوبه شدن در دمای ?37 معرف شماره دو اضافه گردید. در نهایت پس از مخلوط شدن نمونه با معرف های یک و دو، مقدار جذب نوری در دقایق 1، 2 و 3 با استفاده از اسپکتروفتومتر (مدلDTS.7333) خوانده شد و طبق فرمول میزان هر آنزیم، محاسبه گردید.
محاسبه آنزیم ALT: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 100( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 5 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد 19?? ضرب گردید.
محاسبه آنزیم AST: نحوه محاسبه این آنزیم در روشی کاملاً مشابه به آنزیم ALT انجام میگیرد.
محاسبه آنزیم ALP: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 20( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 405 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد 3433 ضرب گردید.
محاسبه آنزیم LDH: نحوه محاسبه این آنزیم بدین صورت است که ابتدا نمونه l)µ 10( با معرف اول (lµ 1000) ترکیب شده و پس از مخلوط نمودن، 1 تا 5 دقیقه در 37 درجه انکوبه و سپس معرف شماره دوم (lµ 250) اضافه میگردید. پس از مخلوط کردن، مقدار جذب نوری را بعد از 1 دقیقه در طول موج 340 نانومتر خوانده شده و بلافاصله کرونومتر را بکار انداخته و دقیقاً پس از 1، 2 و 3 دقیقه، اختلاف جذب نوری از دقیقه قبل تعیین گردید. در نهایت مقدار اختلافات جذب نوری پس از دقایق 1، ?و 3 با هم جمع و بر عدد 3 تقسیم و میانگین بدست آمده در عدد 20000 ضرب گردید.
2-6- سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولهای کبد:
نحوه تهیه معرف آزمایش: 0/5 گرم تیوباربیتوریک اسید ((TBA در تری کلرو استیک اسید ((TCA ??% رقیق گردیده و به حجم 100 میلی لیتر رسانده شد.
سنجش میزان پراکسیداسیون لیپیدهای غشای سلولهای کبد طبق روش ارائه شده توسط Heath و همکارش بر اساس تشکیل کمپلکس مالون دی آلدهید صورت گرفت (Heath and packer, 1986). 0/1 گرم از نمونه بافت کبد وزن گردید و همراه 5 میلی لیتر تری کلرو استیک اسید هموژنیزه شد. سوپرناتانت بدست آمده به مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد. سپس 1 میلی لیتر از محلول شفاف رویی به لوله آزمایش منتقل گردیده و 1/5 میلی لیتر از معرف به آن اضافه شد. لولههای آزمایش در حمام آب با دمای جوش قرار داده شدند و پس از 30 دقیقه به ظرف یخ منتقل گردیدند.
مقدار تشکیل کمپلکس مالون دی آلدهید (TBA-MDA) با اندازهگیری جذب محلولها در طول موج 532 نانومتر مشخص شد. از آنجاییکه بعضی ترکیبات بعنوان مواد مزاحم عمل مینمایند، جذب را در 600 نانومتر خوانده و از جذب خوانده شده در طول موج 532 نانومتر کسر گردید. غلظت کمپلکس TBA-MDA با استفاده از ضریب خاموشی = 1/56×105? و معادله زیر محاسبه شد:
A=?bc
در این معادله، A میزان جذب خوانده شده، ? ضریب خاموشی، b عرض کووت بر حسب سانتی متر و c غلظت کمپلکس میباشد که بر حسب مول بر گرم وزن تر محاسبه گردید.
?-7- بررسی هیستوپاتولوژی کبد
جهت مطالعات هیستوپاتولوژی، قطعهای از لوب بزرگ با دقت جدا و در محلول فرمالین 10% نگهداری شد. این بافر به صورت زیر تهیه گردید:
مراحل مختلف پاساژ بافتی برای تهیه بلوکهای پارافینی از بافت مورد نظر که در این تحقیق بصورت دستی صورت گرفت به شرح زیر میباشد (Bancroft and Stevens, 1990).
1-آب گیری (Dehydration)
آب گیری به خارج کردن کامل آب بافت به کمک مواد شیمیایی گفته می شود. این کار با استفاده از عبور بافتها از ظروف حاوی الکل صورت میگیرد. چون در صورت خروج سریع آب از بافت، نمونه دچار چروکیدگی میگردد پس برای جلوگیری از این حالت از محلولهای الکلی با درصدهای کم شروع کرده تا به الکل مطلق 100% برسد. محلولهای الکلی به ترتیب با رقتهای 70%، 80%، 96% و 100% استفاده گردیدند.
2- شفاف سازی (Clearing)
بعد از آبگیری کامل بافت از یک محلول واسطه به علت غیر قابل حل بودن پارافین در الکل و جهت شفاف سازی استفاده میشود. رایج ترین محلولهای مورد استفاده، گزیلول میباشد. برای اطمینان از خروج کامل الکل از 2 ظرف حاوی گزیلول استفاده گردید.
3- آغشته سازی با پارافین (Impregnation)
آغشته سازی یعنی اشباع شدن کامل بافت با ماده ای که نمونه باید بوسیله آن قالب گیری شود. بدین ترتیب جهت تهیه مقاطع پارافینی از پارافین استفاده می گردد تا بطور کامل جایگزین گزیلول شود. با توجه به اینکه نقطه ذوب پارافین 60 درجه سانتی گراد است دمای انکوباتور روی این درجه ثابت شده و نمونه های بافتی کبد وارد ظرف حاوی پارافین مذاب گردید. زمان بندی مراحل مختلف آماده سازی بافتی تا این مرحله به شرح زیر میباشد:
فرمالین حداقل 24 ساعت الکل 70% (1-2 ساعت) الکل80% (1-2 ساعت) الکل 96% (1-2 ساعت) الکل 100% (1-2 ساعت) گزیلول (1-2 ساعت) گزیلول ( 1-2 ساعت) پارافین 60 درجه (حداکثر 24 ساعت)
?- قالب گیری (Embedding)
جهت تهیه قالبهای پارافینی از قالبهای پارافینی فلزی (Base mold) استفاده گردید. بدین صورت که هر قالب را از پارافین مذاب پر کرده و نمونه های بافت کبد به صورتی در قالب گذاشته میشوند که محور طولی آنها در ته قالب قرار میگیرد. بدین ترتیب برشهای عرضی از نمونهها تهیه میگردد. در حین سرد شدن پارافین، مشخصات هر نمونه روی کاغذ نوشته و در گوشه قالب پارافینی قرار داده شد.
مقطع گیری (Sectioning)
جهت مشاهده بافتهای آماده شده، با میکروسکوپ نوری، مقاطع بافتی با ضخامت 6 میکرون توسط دستگاه میکروتوم دوار تهیه گردید تا نور بتواند از آنها عبور کند. برشهای تهیه شده از بافت کبد توسط چسب egg albumen به سطح لام چسبانده شدند.
رنگ آمیزی (Staining)
در این پژوهش از دو نوع رنگ آمیزی استفاده گردید:
رنگ آمیزی اختصاصی آهن (پروسین بلو21)
رنگ آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین
روش انجام هر کدام در زیر آمده

این مطلب رو هم توصیه می کنم بخونین:   پایان نامه ارشد رایگان دربارهصحت معامله، فقه و قانون، امام صادق
دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید